纖維素含量（CLL）測試盒  

微量法 100管/96樣

正式測定前取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起，是植物細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分。纖維素是一種重要的膳食纖維，是自然界中分布廣、含量最多的一種多糖。

測定原理：

纖維素為β－葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱能分解成β－葡萄糖。β－葡萄糖在強酸作用下，可脫水生成β－糠醛類化合物。β－糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合，生成糠醛衍生物。顏色的深淺可間接定量測定纖維素含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、80％乙醇、丙酮、濃硫酸（不允許快遞）、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL× 1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體10mL× 1支，4℃保存。

樣品的前處理：

1. 細胞壁的提取：取約0.3g樣本，加入1mL 80％乙醇，室溫快速勻漿，90℃水浴20min（加熱過程中EP管可能爆開，建議用膠帶封口或使用防爆EP管），冷卻至室溫，6000g 25℃離心10min，棄上清。沉淀加入1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍（渦旋振蕩2min左右，6000g 25℃離心10min，棄上清即可），沉淀即為粗細胞壁，加入1mL試劑一（去除淀粉）浸泡15小時，6000g 25℃離心10min，棄上清，將沉淀干燥，稱重得細胞壁物質(zhì)（CWM）。

2. 纖維素的提取：稱取烘干的CWM 約5mg，加入0.5mL蒸餾水充分勻漿(若烘干物質(zhì)質(zhì)地堅硬，可先研碎后再加入0.5mL蒸餾水勻漿，或者用勻漿器勻漿)，勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管中，用蒸餾水定容至0.5mL，置于冰水浴中，緩慢加入0.75mL濃硫酸，混勻，冰水浴中靜置30min。8000g 4℃離心10min，取上清液，用蒸餾水稀釋20倍后待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至95度。

3、工作液的配制：在試劑二中加入4mL試劑三，充分溶解，如較難溶解，可加熱攪拌；用不完的試劑4℃保存一周；

4、加樣表（在EP管中反應(yīng)）：

混勻，置95度水浴中10min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻至室溫后，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，于620nm處，分別讀取空白管和測定管吸光值，ΔA=A測定管-A空白管。

注意：

1、空白管只要做一管。

2、由于濃硫酸具有強腐蝕性，請謹慎操作。

纖維素含量計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為y = 7.875x - 0.0043；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、按樣本質(zhì)量計算：

纖維素（mg /g干重）= [(ΔA＋0.0043) ÷7.875×V1]÷（W×V1÷V2）×20=3.17×(ΔA＋0.0043) ÷W。

V1：加入樣本體積，0.15mL；V2：加入提取液體積，1.25mL；W：樣本干重，5×10-3g；20：樣本稀釋倍數(shù)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為y = 5.25x - 0.0043；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、按樣本質(zhì)量計算：

纖維素（mg /g干重）= [(ΔA＋0.0043) ÷5.25×V1]÷（W×V1÷V2）×20=4.76×(ΔA＋0.0043)

÷W。

V1：加入樣本體積，0.15mL；V2：加入提取液體積，1.25mL；W：樣本干重，約5×10-3g；20：樣本稀釋倍數(shù)。

注意：*低檢測限為1mg/g干重或10ng/ mg prot

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