花青素還原酶（ANR）測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

花青素還原酶是黃酮合成途徑中的關鍵酶，在植物體內起非常重要的調控作用，對花青素還原酶的調控機制研究有利于從基因水平改變植物的品質。

測定原理

花青素還原酶在NADPH存在的條件下作用于飛燕草色素轉變為表沒食子兒茶素和NADP，使反應體系在340nm處的吸光值下降，吸光值下降速率反應了花青素還原酶的活性。

需自備的儀器和用品

天平、研缽、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

酶液提取

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 培養液等液體：直接檢測。

測定操作表

充分混勻，于微量石英比色皿/96孔板測定340處吸光值A1，然后在40℃溫育20min后，再測定340nm處吸光值A2，△A=A1-A2

酶活性計算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

ANR活性（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T

                           = 80.39×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每克組織每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

ANR活性（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T

                      = 80.39×ΔA÷W

3. 按液體體積計算

酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

ANR活性（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

                        = 80.39×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，20min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

2. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

ANR活性（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T

                           = 160.78×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每克組織每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

ANR活性（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T

                      = 160.78×ΔA÷W

（3）按液體體積計算

酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

ANR活性（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

                        = 160.78×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，20min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

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