β半乳糖苷酶（βGAL）測試盒

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解，此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量，還能在正常的多糖代謝、細胞壁組分代謝以及衰老時細胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解，釋放自由的半乳糖。

測定原理：

β-GAL分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL活性。

自備用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2.5mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體13mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、培養(yǎng)液等液體樣本：直接檢測

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入37℃保溫30min

充分混勻， 400nm處測定吸光值A(chǔ)，計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

β-GAL活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.00585x -0.0027；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

（4）按液體體積計算：

單位的定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷V樣÷T

=39.89×(ΔA+0.0027)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.07mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，30min。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.12×(ΔA +0.0027)

（4）按液體體積計算：

單位的定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

β-GAL活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷V樣÷T

=59.83×(ΔA+0.0027)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.07mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，30min。

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