迄今為止，許多生命過(guò)程背后的確切機(jī)制仍然難以捉摸，因?yàn)槲覀儭坝^察"蛋白質(zhì)微小部分及其相互作用的方法受到限制。現(xiàn)在，一種新的混合技術(shù)利用了電子顯微鏡、納米技術(shù)、復(fù)雜的圖像處理和 3D 繪圖軟件以及標(biāo)記和測(cè)量蛋白質(zhì)的方法的力量。突破性的方法是從讀取 DNA 本身的物理啟動(dòng)開(kāi)始，揭示我們最微小的運(yùn)動(dòng)部件的結(jié)構(gòu)和功能。

轉(zhuǎn)錄對(duì)于細(xì)胞基因的表達(dá)至關(guān)重要，即“讀取"DNA 片段以開(kāi)始產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。其中一個(gè)關(guān)鍵角色是 RNA 聚合酶 II（RNAPII），它是一種從起始 DNA 合成信使 RNA 的納米機(jī)器。同樣重要的是它的助手 TFIIF，它可以識(shí)別 DNA 啟動(dòng)子并向 RNAPII 發(fā)出信號(hào)，從哪里開(kāi)始讀取一定長(zhǎng)度的遺傳密碼。到目前為止，這對(duì)動(dòng)態(tài)二人組相互作用背后的機(jī)制仍然難以捉摸，因?yàn)樘《鵁o(wú)法可視化。

在中國(guó)臺(tái)灣，Wei-hau Chang 博士和他的團(tuán)隊(duì)開(kāi)創(chuàng)了一種混合技術(shù)，對(duì)這些重要蛋白質(zhì)復(fù)合物的解剖結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了深入的認(rèn)識(shí)。他們超越了冷凍電鏡和 X 射線晶體學(xué)的界限，使用一種新穎的電子顯微鏡成像技術(shù)進(jìn)行單顆粒分析，然后通過(guò) FRET 分析進(jìn)行微小測(cè)量，以進(jìn)一步提高其繪圖的精度。他們的發(fā)現(xiàn)不僅解開(kāi)了 TFIIF 在 RNAPII 上的位置之謎，而且還揭示了這些是移動(dòng)部件，發(fā)生戲劇性的轉(zhuǎn)變以與 DNA 結(jié)合——讓我們第一次看到基因轉(zhuǎn)錄的物理起始過(guò)程。

當(dāng)他們著手研究由 TFIIF 和 RNAPII 形成的 DNA 讀取復(fù)合物的結(jié)構(gòu)時(shí)，Chang 等人。需要用更明顯的標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記難以看到的蛋白質(zhì)，然后可以用它來(lái)確定它們的確切位置。他們首先用 Nanogold®（一種單一的金納米顆粒）標(biāo)記 TFIIF 蛋白的末端；黃金的電子密度很高，因此在電子顯微鏡下會(huì)顯得明亮。該團(tuán)隊(duì)利用酵母中的基因表達(dá)技術(shù)，在 TFIIF 上創(chuàng)建了帶有 10 個(gè)組氨酸的 TAP 標(biāo)簽，然后該標(biāo)簽與 Nickel-NTA-Nanogold ® (Nanoprobes Inc.)緊密結(jié)合，為他們的 EM 工作提供了清晰的標(biāo)記。

分析的第一階段結(jié)合了兩種成像方法和電子顯微鏡。更加散焦的視圖實(shí)際上增加了與較大物體的對(duì)比度，從而使蛋白質(zhì)復(fù)合物整體成形；對(duì)于這組圖像，該小組使用了更大的 5 nm Ni-NTA-Nanogold 標(biāo)記物。接下來(lái)，使用高度聚焦的圖像清晰地識(shí)別出單個(gè)微小的金納米顆粒；在這里，該小組使用 1.8 nm Ni-NTA-Nanogold 以最高精度標(biāo)記他們的目標(biāo)。兩個(gè)視圖共同形成了一幅圖像，顯示了微小 TFIIF 轉(zhuǎn)錄起始子的位置，以及它如何融入更大的 RNAPII 轉(zhuǎn)錄機(jī)器。軟件分析了數(shù)千個(gè)圖像對(duì)，創(chuàng)建了詳細(xì)的蛋白質(zhì) 3D 圖譜。

第二階段的分析使用 FRET 分析帶來(lái)了更高的精度。在這里，熒光“發(fā)射機(jī)"標(biāo)記被放置在 RNAPII 轉(zhuǎn)錄機(jī)上的穩(wěn)定點(diǎn)，“受體"標(biāo)記被放置在 TFIIF 蛋白上。一段時(shí)間后，接收器收集到的能量可以用來(lái)計(jì)算其與發(fā)射器的準(zhǔn)確距離。對(duì)許多樣品的分析進(jìn)一步完善了 TFIIF 蛋白在 RNAPII 復(fù)合物上的定位，結(jié)合 EM 數(shù)據(jù)創(chuàng)建了詳細(xì)的圖譜。

然而，Chang 的團(tuán)隊(duì)所做的遠(yuǎn)不止簡(jiǎn)單地繪制這些蛋白質(zhì)的孤立結(jié)構(gòu)。他們還展示了帶有基因序列的起始前轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，并使用他們的方法來(lái)檢查 TFIIF 起始子在遇到 DNA 啟動(dòng)子時(shí)的定位。他們發(fā)現(xiàn) TFIIF 會(huì)做出劇烈的物理運(yùn)動(dòng)作為響應(yīng)，這實(shí)際上將 DNA 移向 RNAPII 轉(zhuǎn)錄機(jī)的葉/突出區(qū)域。這可能代表了轉(zhuǎn)錄起始位置的動(dòng)力學(xué)選擇，并且是在行動(dòng)中觀察到的基本生命過(guò)程開(kāi)始背后機(jī)制的第一個(gè)視圖。

作者寫道：“我們相信這種方法對(duì)于研究許多蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)通常很有用。"他們將他們的兩步過(guò)程比作“用谷歌地圖放大"。事實(shí)上，張的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)找到了一種方法來(lái)“看到"我們至關(guān)重要的納米機(jī)械中極其微小的部分，從而可以真正了解它們?cè)趧?chuàng)造和支持生命本身時(shí)的相互作用和功能。

“這種結(jié)合了多種技術(shù)的新技術(shù)確實(shí)為更深入地了解細(xì)胞過(guò)程如何工作打開(kāi)了大門，" Nanoprobes 的科學(xué)家James F. Hainfeld 博士說(shuō)，該公司是Chang 技術(shù)中使用的Ni-NTA-Nanogold ®的制造商。 “這是一個(gè)以高分辨率繪制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖的好工具。"