熒光是指光致發光現象。當某種室溫物質受到一定波長的入射光照射時，分子中的電子吸收光能后達到高能級，進入激發態，并立即去激發并恢復到原來的狀態，而多余的能量則以光的形式輻射出去，即發出比入射光波長更長的光（通常在可見光波段）。一旦停止入射光，發光現象立即消失。也就是說，當物體吸收短波光的能量時，它可以發射比原來吸收的波長更長的光。具有這種性質的物質或分子稱為熒光素或熒光染料。

當激光束與細胞正交時，通常會產生兩個熒光信號。一是細胞本身在激光照射下發出微弱的熒光信號，稱為細胞自發熒光；定量分析可以深入了解所研究的細胞參數的存在和定量。

(1) 熒光信號的意義

熒光信號可以反映不同細胞的生物學特性。例如，熒光染料標記的單克隆抗體與細胞表面的抗原、受體或膜糖蛋白特異性結合，在激光的激發下發出一定波長的熒光。熒光信號的強度反映了膜抗原、受體或糖蛋白的相對數量。通過收集和分析熒光信號，可以實現細胞亞群和功能的分析。 DNA用DNA染料染色，染料以一定的方式與DNA鏈結合。在激光的激發下，染料發出熒光，通過測量熒光的強度，可以獲得相對DNA含量，進而確定細胞周期階段。分析。使用特定的熒光染料還可用于測量細胞鈣離子濃度、細胞內pH值和細胞膜電位。

(2)熒光染料的選擇

可以使用的熒光染料有很多種，由于它們的分子結構不同，它們的熒光激發和發射光譜也不同。選擇染料或單克隆抗體標記的熒光素時，必須考慮儀器配置的激光光源的波長，即染料的激發光譜；儀器激光器的激發光波長盡可能接近熒光染料的激發光譜峰；另外，熒光染料還必須考慮染料的發射顏色，即染料的發射光譜，需要選擇合適波段的檢測器來檢測相應的熒光信號。

由于目前的流式細胞儀配備有多個熒光信號檢測器，當儀器同時檢測多個熒光時，每個熒光檢測器只允許一定波長的熒光信號進入并被檢測，因此用戶必須選擇合適的熒光信號接收器才能接收好的信號。還需要注意的是，使用激光波長相同的熒光染料，其發射波長不同，這樣才能被相應波段的檢測器接收到，達到同時檢測的目的。

檢測器的選擇基于了解熒光染料的發射光譜。以三色FCM為例，如果熒光光譜峰落在綠色范圍內（波長515-545nm），則選擇第一個熒光檢測器；如果光譜值落在橙紅色范圍內(564-606nm)，則選擇第二熒光檢測器；如果熒光光譜值落在深紅色范圍內（波長650 nm），則選擇第三個熒光檢測器。目前桌面FCM常用的激光為488nm，常用的染料有PI、PE、FITC、PERCP、CY5、APDye Fluors等。

(3) 熒光標記抗體組合

在使用流式細胞術進行多色分析時，如果想要得到理想的分析結果，需要選擇抗體的熒光匹配。經常考慮的因素如下。

1 熒光素的熒光強度

特定抗體區分陰性和陽性結果的能力取決于該抗體標記的熒光素。每種熒光素具有不同的光子釋放能力和不同的相對熒光強度。一般用染色指數來比較不同熒光標記的光信號強度。染色指數是陽性信號與陰性信號之差與陰性峰分布寬度的比值，用于判斷熒光染料區分弱陽性表達的能力。同一個單克隆抗體用8種不同的熒光素標記，得到不同的染色結果。我們需要找到一種具有更高染色指數的熒光染料來標記微弱的信號。

可以看出，對于特定的單克隆抗體，由于使用不同的熒光素標記，陰性核陽性細胞的S/N比（信噪比）可相差4-6倍。一般來說，熒光信號由強到弱的順序為：PE>APC>PE-CY5>PERCP-CY5.5>FITC>PERCP。

選擇熒光標記抗體時，需要考慮以下因素：

熒光素標記效率：抗體上標記的熒光素量（F/P）值也會影響相對熒光強度。每個抗體可以標記多個 FITC 或 PERCP 分子（通常為 2-9 個），而 APC 和 PE 標記的量約為每個抗體一個熒光分子。 FITC是小分子化合物，而PE、PERCP和APC是分子量較大的熒光蛋白。受熒光標記化學性質的限制，IGM型抗體通常僅標記小分子熒光素，如FITC、TEXAS RED、CY3和CY5等。

抗體檢測的抗原密度：高表達的抗原幾乎可以用任何熒光素標記的抗體來檢測，而低表達的抗體則需要用信噪比較高的熒光素標記的抗體來檢測，從而有效區分陽性細胞群和陰性細胞目的。

細胞自發熒光：每個細胞群的自發熒光水平各不相同，盡管可以觀察到高熒光強度的細胞，但在高波長范圍（>600nm）中自發熒光迅速下降。當檢測具有高水平自發熒光的細胞時，使用具有較長發射波長的熒光染料（例如 APC）可以獲得更好的信噪比。如果是自發熒光水平較低的細胞，那么使用較長波長的激發光對于改善正負差異的現象影響不大。可以使用 FITC 標記的抗體。

2 非特異性結合

一些熒光標記抗體表現出低水平的非特異性結合，導致陰性細胞中的熒光水平增加。這種非特異性結合通常由兩個因素引起：

單克隆抗體的同型對照：一些 IGG 型同型對照對某些細胞類型的 FC 受體結合更敏感

使用熒光素：有時 CY3、CY5、CY5.5 和德克薩斯紅直接標記的抗體以及一些串聯偶聯抗體可增強與某些細胞亞群的結合。對于CY5，研究表明，這主要是由于染料與低親和力FC受體的相互作用較弱； PE-CY5標記的抗體也有類似的效果。另外，在某些情況下（例如用抗HLA-DG PE/抗單核細胞PerCP-CY5.5分析單核細胞），該功能也可用于有意增加標記抗體中CY染料的標記量，這確保了無論每個單核細胞的 CD14 表達水平有何差異，都可以檢測到單核細胞。

總之，在通過流式細胞術進行多色分析時，應仔細選擇熒光抗體標記的熒光染料。主要影響因素有：根據不同型號選擇合適的熒光抗體（激光功率和波長）；染色細胞抗原表達的相對密度（表達密度低的抗原應選擇較亮的熒光染料）； FC 對陰性細胞受體狀態。另外，在進行多色分析時，需要盡可能選擇熒光波之間光譜重疊較少的熒光染料進行組合，同時需要進行正確的調整和補償。

3. 熒光補償的調整

當細胞攜帶兩種或多種熒光素（如PE和FITC）并被激光激發發射兩種以上不同波長的熒光時，理論上可以選擇濾光片使得每種熒光只能被相應的檢測器檢測到，而將不會檢測到其他熒光。然而，由于目前使用的各種熒光染料具有較寬的發射光譜特性，雖然各自的發射峰不同，但發射光譜范圍有一定程度的重疊，因此少量不需要檢測的另一種熒光信號也會被檢測到。被檢測到。是通過這個光電倍增管來檢測的，所以每個光電倍增管實際上檢測的是兩種熒光的總和，只不過每種熒光都以某一種熒光為主。熒光素的發射光譜有一定的范圍，其發射信號的極小部分必然會進入另一次檢測。 FITC 檢測器將檢測少量的 PE 光譜，而 PE 光譜檢測器將檢測更多的 FITC 光譜。

由于光譜重疊占檢測信號的一定比例，因此熒光補償的方法是從接收到的熒光信號中減去另一檢測器中接收到的信號（即光譜重疊）的一部分，從而使另一檢測器信號 該檢測器檢測到的信號與負背景信號一致，因此光電倍增管中輸出的信號實際上僅代表一定檢測的信號，而不受其他波長的熒光信號的干擾。利用標準的已知單陽性樣本，可以合理設定熒光信號的補償值。補償程度可以通過同時測量雙熒光參數的儀器條件來確定。補償時，首先測量染料的熒光 (FL1)。此時，除了應接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器有信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常出現微弱的輸出。調整補償 然后調整補償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與負信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調節補償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與負信號匹配。負面信號是一致的。如此反復調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償。除了應接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器的信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常輸出微弱。調整補償 然后調整補償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與負信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調節補償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與負信號匹配。負面信號是一致的。如此反復調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償。除了應接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器的信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常輸出微弱。調整補償 然后調整補償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與負信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調節補償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與負信號匹配。負面信號是一致的。如此反復調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償。調整補償 然后調整補償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與負信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調節補償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與負信號匹配。負面信號是一致的。如此反復調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償。調整補償 然后調整補償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與負信號一致；然后測量另一種染料（FL2），然后調節補償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與負信號匹配。負面信號是一致的。如此反復調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償。

進行多色分析時，必須使用每個熒光素單陽性樣品進行檢測，并調整與其他熒光通道的補償，以保證多色分析結果的準確性。由于多色分析熒光補償的復雜性，許多分析軟件都允許離線補償，這為操作者提供了極大的便利。

值得注意的是，補償與特定實驗的特定熒光素組合、特定儀器條件設置有關。補償設置后，如果光電倍增管的電壓、激光器的波長、濾光系統等發生變化，熒光補償值就會發生變化，需要重新調整補償。