Nanogold®-鏈霉親和素原位雜交

1.4 nm Nanogold® 金納米粒子探針 體積小，不聚集，因此能夠接觸核抗原，這使得它們成為超靈敏原位雜交檢測特定 DNA 序列（無論是否使用原位PCR）的優(yōu)秀試劑。

內(nèi)容

• Nanogold®-鏈霉親和素原位雜交

• Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"系統(tǒng)

• 使用 Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"系統(tǒng)進(jìn)行 RNA 檢測

• 使用 Nanogold®-鏈霉親和素-銀進(jìn)行免疫標(biāo)記來檢測針對單克隆一抗的生物素化二抗

優(yōu)點(diǎn)

• 結(jié)合標(biāo)簽擴(kuò)增單基因拷貝分辨率，比 NBT-BCIP 堿性磷酸酶或過氧化物酶更靈敏。

• 大多數(shù)情況下不需要更冗長的 PCR 程序。

• 避免由于錯誤引發(fā)和擴(kuò)增子擴(kuò)散而導(dǎo)致 PCR 出現(xiàn)假陽性。

• 使用標(biāo)準(zhǔn)明場顯微鏡可輕松看到黑色；不需要昂貴的熒光光學(xué)器件，也沒有自發(fā)熒光和漂白信號丟失的問題。

• 黑色與全強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞和核染色劑（H＆E、核固紅、甲基綠）兼容，極大地改善了形態(tài)學(xué)評估。

• 也可用于 EM 研究。

單獨(dú)給出了 Nanogold®-鏈霉親和素原位雜交的完整方案，無論是否有 CARD 系統(tǒng)。

Nanogold®-鏈霉親 和素原位雜交

© 伊頓出版公司；經(jīng)許可使用。

圖 1：納米金-銀原位雜交技術(shù)的示意圖。通過與生物素標(biāo)記的 cDNA 探針雜交來檢測宿主細(xì)胞中的 DNA 序列。然后使用鏈霉親和素-Nanogold 檢測與間隔臂共價結(jié)合的生物素，并隨后使用乙酸銀或乳酸銀自動金相術(shù)進(jìn)行銀增強(qiáng)。為簡單起見，僅顯示了四種此類生物素和鏈霉親和素-Nanogold 分子。 Hacker, GW、Hauser-Kronberger, C.、Zehbe, I.、Su, H.、Schiechl, A.、Dietze, O. 和 Tubbs, R.；細(xì)胞視覺， 4，54-65（1997）。

 

 

使用該方法檢測人乳頭瘤病毒6/11型基因組如下所示；可以看出，Nanogold®-銀染色產(chǎn)生濃密的黑色信號，在許多情況下比使用傳統(tǒng)酶底物獲得的信號更清晰。

納米金銀 ISH 檢測尖銳濕疣中的 HPV 6/11。在這種情況下，獲得了強(qiáng)標(biāo)記。大多數(shù)感染的細(xì)胞核呈致密黑色或顆粒狀黑色染色。一些細(xì)胞核還顯示出單個黑點(diǎn)標(biāo)記，表明這種 DNA 病毒的拷貝數(shù)非常低。染色如方案中所述；福爾馬林固定、7 微米厚的石蠟切片，用蘇木精和伊紅復(fù)染。放大倍數(shù)，X 285。

Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"系統(tǒng)

CARD - 催化報告沉積（也稱為TSA® 或酪酰胺信號放大；可從NEN Life Sciences獲得的試劑盒） - 是一種系統(tǒng)，其中鏈霉親和素連接的過氧化物酶分子用于在感興趣的位點(diǎn)催化積累生物素化的酪酰胺。這在使用 Nanogold®-鏈霉親和素和銀增強(qiáng)進(jìn)行檢測之前，在程序中插入了額外的擴(kuò)增步驟；結(jié)果是靈敏度大幅提高，從而可以檢測單拷貝基因，而不會遇到 PCR 相關(guān)的困難。

圖2：CARD-納米金-銀 原位雜交技術(shù)的示意圖。通過與 FITC 標(biāo)記的核糖核酸探針雜交來檢測宿主細(xì)胞中的 RNA 序列。然后針對 FITC 的第一抗體層與用作核酸報道分子的 FITC 分子結(jié)合。下一層是針對提供一抗的物種 IgG 的二抗，用生物素標(biāo)記。為了簡單起見，僅顯示了這兩種抗體中的每一種。然后生物素與鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶（S-ABC-過氧化物酶）復(fù)合物結(jié)合。顯示了四個這樣的分子，每個分子都攜帶過氧化物酶。然后，這些過氧化物酶分子催化生物素化酪酰胺的積累（催化報告沉積），最終導(dǎo)致生物素標(biāo)記的“倍增"。作為最后一層，鏈霉親和素-Nanogold隨后使用醋酸銀或乳酸銀放大（自動金相學(xué)）。這些最終的鏈霉親和素分子中的每一個都可以檢測許多生物素分子中的一個。通過這種方式，可以實現(xiàn)巨大的擴(kuò)增，在許多情況下無需 PCR 或 3SR 技術(shù)即可實現(xiàn)單基因拷貝敏感性。

Hacker, GW、Hauser-Kronberger, C.、Zehbe, I.、Su, H.、Schiechl, A.、Dietze, O. 和 Tubbs, R.；細(xì)胞視覺， 4，54-65（1997）。

© 伊頓出版公司；經(jīng)許可使用。

該程序用于檢測宮頸癌標(biāo)本培養(yǎng)的 SiHa 細(xì)胞中的 HPV-16（一種 cDNA 病毒）。已知這些細(xì)胞僅含有一到幾個病毒 DNA 拷貝； Nanogold®-鏈霉親和素原位雜交與 CARD 結(jié)合產(chǎn)生細(xì)胞核的致密黑色顆粒染色；黑色信號比過氧化物酶-鏈霉親和素產(chǎn)生的信號更容易區(qū)分。該程序可能會在 5 至 7 小時內(nèi)完成；

通過 CARD 擴(kuò)增的納米金銀ISH 檢測到 SiHa 細(xì)胞中 HPV 16 的單拷貝。這種源自宮頸癌的細(xì)胞系僅含有一到幾個 HPV 16 拷貝，通過所應(yīng)用的技術(shù)顯示為單個斑點(diǎn)（詳細(xì)信息請參閱實驗方案）。細(xì)胞離心涂片制備，用核固紅復(fù)染。在福爾馬林固定石蠟材料的組織切片中獲得了類似的染色(Zehbe等人，Am.J.Pathol.150 , 1553-1561(1997))。原始放大倍數(shù)，X 560。

使用 Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"系統(tǒng)進(jìn)行 RNA 檢測

RNA的檢測具有同樣高的靈敏度，如下圖：

霍奇金病中的 Epstein-Barr 病毒；使用RNA 檢測方案進(jìn)行高靈敏度檢測的示例。原始放大倍數(shù)，X 400。

使用 Nanogold®-鏈霉親和素-銀進(jìn)行免疫標(biāo)記來檢測針對單克隆一抗的生物素化二抗

Nanogold®-鏈霉親和素在免疫標(biāo)記實驗中也能發(fā)揮良好作用。下面顯示了一個例子，其中它用作針對針對單克隆一抗的生物素化多克隆二抗的三級探針，以探測乳腺癌抗原。

使用間接 Nanogold® 標(biāo)記檢測 Ki-67 乳腺癌抗原。使用一抗和生物素化山羊抗小鼠二抗檢測 Ki-67 抗原；使用 Nanogold®-鏈霉抗生物素蛋白（250 倍稀釋）和自動金相學(xué)對其進(jìn)行可視化。原始放大倍數(shù)，X 400。